+7 (496) 549-95-75

Проект № 14-16-00140 (РНФ)

Номер 14-16-00140

Название: Современные представления о микрофлоре кишечника птицы при различных рационах питания: молекулярно-генетические подходы.

Руководитель: Фисинин Владимир Иванович, Доктор сельскохозяйственных наук

Организация финансирования, регион: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Федеральный научный центр "Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства" Российской академии наук, Московская обл

Года выполнения при поддержке РНФ: 2014 - 2016

Конкурс: Конкурс 2014 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора: 06 - Сельскохозяйственные науки, 06-204 - Животноводство

Ключевые слова: микрофлора кишечника кур, комбикорм, кормовые добавки, T-RFLP-анализ, NGS-секвенирование, здоровье животных, продуктивность, конверсия

Код ГРНТИ: 68.39.37

Статус: Успешно завершен

Аннотация

Цель проекта заключается в изучении закономерностей организации микробных сообществ кишечника кур в зависимости от рационов питания. Актуальность проекта определяется значением отрасли птицеводства для человека и важностью повышения эффективности отрасли за счет применения компонентов рационов кур, влияющих на микрофлору кишечника. Для достижения поставленной цели предполагается изучить состав и структуру микробных сообществ кишечника кур с применением молекулярно-генетических методов на фоне комбикормов различного состава. На основе полученных результатов будут разработаны рекомендации по коррекции микрофлоры кишечника кур и будут определены нормы полезных микроорганизмов.

Ожидаемые результаты

Данные по структуре и составу микробных сообществ кишечника кур разного возраста на фоне комбикормов различной питательности. Рекомендации по коррекции микрофлоры кишечника кур и нормы полезной микрофлоры определенные на фоне комбикормов различного состава. По результатам проекта будут опубликованы статьи и монографии.


Аннотация результатов, полученных в 2014 году


В ходе выполнения проекта за 1-й год получены следующие результаты: Были заложены и проведены 5 кормленческих опытов на цыплятах-бройлерах кросса «Кобб 500». Кормленческие опыты различались по составу и питательности комбикормов. В комбикормах варьировали структуру, состав белковой и углеводной части, и, соответственно, питательность. На полученных в ходе проведения опытов пробах содержимого кишечника бройлеров были отработаны различные методические подходы для определения состава микрофлоры кишечника.

Были использованы следующие виды молекулярно-генетических подходов: ПЦР в реальном времени, T-RFLP-анализ, NGS-секвенирование. Оптимальной методикой для оценки микробных сообществ был выбран T-RFLP-анализ в сочетании с определением общей численности бактерий посредством ПЦР в реальном времени. Проведен анализ микробных сообществ кишечника цыплят-бройлеров, получавших комбикорма с различным соотношением питательных веществ, и с различной питательностью.

Было обнаружено, что увеличение в рационах питания бройлеров количества субстратов (пшеница, ячмень, шрот подсолнечниковый), богатых некрахмалистыми полисахаридами, приводит к изменению микробиоценозов кишечника по видовому составу и структуре. Меняется видовой состав, как полезных бактерий, так и патогенов, что отражается на основных зоотехнических показателях выращивания птицы и использовании основных питательных веществ комбикорма. В ходе выполнения проекта было проведено сопоставление методических подходов для анализа микрофлоры кишечника на основе ПЦР в реальном времени, T-RFLP-анализа и NGS-секвенирования. Сравнение данных, полученных с использованием методов T-RFLP и NGS секвенирования, показало сопоставимость результатов. Оба молекулярно-генетических метода позволили эффективно оценить состав микрофлоры кишечника бройлеров. Микробные сообщества кишечника бройлеров впервые в России были выявлены с помощью NGS секвенирования.

Результаты анализа показали, что доминирующими бактериями в слепых отростках являются целлюлозолитические микроорганизмы, что сопоставимо с литературными данными. В ходе исследований по проекту был определен аминокислотный и углеводный состав комбикормов. В первый год выполнения проекта представлено 3 устных доклада на семинарах и отраслевых выставках, опубликовано 5 статей, индексируемых в базе данных РИНЦ.


Аннотация результатов, полученных в 2015 году


На второй год выполнения проекта было изучено влияние различных типов кормовых добавок, корректирующих микрофлору (антибиотики, пробиотики, фитобиотики, пребиотики, фитопробиотики, подкислители, сорбенты) на цыплятах-бройлерах. В работе использовали следующий методический подход: комплекс молекулярно-генетических методов на основе T-RFLP-анализа и ПЦР в реальном времени.

Определили характер структурных изменений в микробном сообществе желудочно-кишечного тракта кур в динамике – от вылупления из яйца до формирования взрослого организма. Данные, полученные с помощью комплекса методов на основе T-RFLP и количественной ПЦР были подтверждены методом NGS-секвенирования. В процессе развития организма птицы наблюдается возрастание общего количества филотипов (отдельных таксономических единиц) бактерий – с 30 у куриных эмбрионов до 224 (26 сутки), 255 (75-е сутки). На 150-е сутки количество филотипов снижается до 175 (в среднем). В куриных эмбрионах было выявлено довольно много видов микроорганизмов, являющихся условными патогенами птицы, в частности E.coli. Их роль остается неясной. В то же время, в куриных эмбрионах полностью отсутствуют такие патогенны, как микоплазмы, пастереллы, кампилобактерии. По-видимому, данные виды интродуцируются в кишечник птицы после вылупления из яйца.

Сравнительная оценка структурных изменений в микробных сообществах кишечника цыплят-бройлеров с применением экологических подходов проведена на основе экологических индексов биоразнообразия: показатель доминирования Симпсона, показатель сходства по Серенсену, показатели видового биоразнообразия (по Маргалефу и Менхинику), индекс выровненности по Пиелу, Шенноновский показатель биоразнообразия. Были установлены взаимосвязи между структурой и количественным составом микробного сообщества, показателями продуктивности животных, химическим составом комбикормов с помощью корреляционного и кластерного анализов.

Было проведено выявление оптимальных уровней микроорганизмов на фоне использования рациона питания, оптимизированного для кросса «Кобб 500». Показано, что состав микрофлоры (в первую очередь, автохтонной и симбиотической) желудочно-кишечного тракта сельскохозяйственной птицы находится в прямой зависимости от возраста и рациона и, принимая активное участие в пищеварении, оказывает влияние на продуктивность и состояние здоровья птиц. По результатам проекта опубликовано 2 статьи в изданиях, индексируемых базой данных Web of Science; 1 статья в изданиях, индексируемых базой данных Scopus, 4 статьи в изданиях, индексируемых базой данных РИНЦ. Подготовлены и изданы 2 методические рекомендации Результаты исследований были продемонстрированы на 4-х международных научных конференциях, в том числе 2-х конференциях за рубежом – в Чехии и Турции.


Аннотация результатов, полученных в 2016 году


В ходе выполнения работ по проекту было проведено определение степени воздействия различных типов кормовых добавок на микрофлору желудочно-кишечного тракта кур-несушек – не менее 4 кормленческих опытов на фоне стандартного рациона питания, оптимизированного для кросса птицы.

Было установлено, что нормофлора слепых отростков всех исследованных кур-несушек была различной. В контроле доля целлюлозолитических бактерий составила 23,39 % от общего количества бактерий сообщества слепых отростков. Внесение различных добавок способствовало как увеличению доли целлюлозолитических бактерий, так и ее снижению. Повысилась доля данных бактерий в варианте с внесением пробиотика 1 до 42,27 %, сорбента 1, подкислителя и антибиотиков. Доля бацилл повысилась в вариантах с внесением сорбента 2 (до 15,23 %) и пробиотика 2 (до 15,21 %) с 6,63 % (контрольный вариант). Внесение подкислителя способствовало резкому росту лактобактерий до 11,8 %. Доли условно-патогенных бактерий были примерно одинаковыми во всех исследованных вариантах. Также практически во всех образцах (кроме сорбента 1) была завышена доля таких патогенных бактерий как фузобактерии. Также практически во всех образцах была повышена доля микоплазм. Внесение обоих пробиотиков и сорбента 2 способствовало снижению доли этих патогенных бактерий. Необходимо отметить, что внесение антибиотиков привело к повышению относительных количеств большинства патогенных бактерий (фузобактерий, стафилококков, пептококков и пастерелл). Внесение пробиотиков и сорбентов способствовало снижению доли этих патогенных бактерий в слепых отростках кур.

Была проведена оценка характера изменений в микробном сообществе желудочно-кишечного тракта кур-несушек в динамике от вылупления из яйца до взрослого организма. Вопрос изучения изменения микробиоценоза пищеварительного тракта сельскохозяйственной птицы в процессе онтогенеза имеет высокую актуальность. Известна важная роль микроорганизмов, населяющих желудочно-кишечный тракт (ЖКТ), которые участвуют в обеспечении птицы питательными веществами, антибиотиками, гормонами, витаминами. Важность исследований обусловлена воздействием экологического соотношения между облигатными видами микроорганизмов пищеварительного тракта в течение жизни на метаболические процессы, состояние здоровья и продуктивность птицы. Интересным и дискуссионным в настоящее время остается также вопрос состава микроорганизмов в кишечнике куриных эмбрионов, поскольку результаты публикуемых исследований весьма немногочисленны.

Несмотря на то, что традиционно кишечник эмбрионов птиц считается стерильным, по сообщениям ряда авторов на основе использования классических микробиологических и молекулярно-генетических методов показана способность микроорганизмов колонизировать ЖКТ птиц на стадии эмбрионального развития. С использованием молекулярно-генетического метода T-RFLP нами было проведено сравнение бактериального сообщества содержимого ЖКТ от 6- и 17-суточных куриных эмбрионов и 26-, 150- и 300-суточных кур-несушек кросса «Хайсекс Уайт» из вивария ФГУП Загорское ЭПХ ВНИТИП (Московская область) и установлены особенности изменения бактериального сообщества ЖКТ птицы в процессе онтогенеза.

Полученные результаты, в отличие от классических представлений, показали присутствие в ЖКТ куриных эмбрионов богатого таксономического разнообразия бактерий, доминирующими среди которых были типичные представители кишечной микрофлоры птиц семейства Enterobacteriaceae (преимущественно Escherichia coli). Также были детектированы обнаруживаемые ранее у вылупившихся цыплят и взрослых птиц представители класса Clostridia (семейств Lachnospiraceae, Eubacteriaceae и др.), филума Bacteroidetes, порядков Negativicutes, Actinomycetales, Bifidobacteriales. Интересно отметить присутствие ряда возбудителей опасных заболеваний животных - бактерий родов Burkholderia, Pseudomonas, Salmonella, Klebsiella, порядка Rickettsiales и др. При этом структура микробиоценоза содержимого ЖКТ эмбрионов кур на 6-е сутки инкубации характеризовалась более высоким таксономическим разнообразием (75±2,75 филотипов) в отличие от 16-суточных (30±1,20 филотипов). В процессе онтогенеза в ЖКТ птицы наблюдалось развитие бактериального сообщества, появление новых микроорганизмов. Спектр выявляемых у 26-суточных цыплят, а также 150- и 300-суточной птицы бактерий был представлен более широко по сравнению с эмбрионами - свыше 175±8,12 филотипов. При этом наименьшее общее разнообразие бактерий и содержание неидентифицированных филотипов отмечено у 300-суточных кур-несушек. У взрослой птицы по сравнению с эмбрионами наблюдалось изменение доминирующих групп микроорганизмов - большее содержание представителей класса Clostridia, класса Negativicutes и меньшее - классов Bacillales, Bifidobacteriales.

Выявленное расширение таксономического разнообразия микроорганизмов у птицы по сравнению с эмбрионами свидетельствует о заселении ЖКТ кур новыми микроорганизмами, включая представителей порядка Lactobacilales, а также ряда патогенов - родов Listeria, Pantoea, Enterobacter, Mycoplasma, Acinetobacter, семейств Pasteurellaceae, Campylobacteraceae, филума Fusobacteria.

Полученные результаты свидетельствуют о становлении микробиоэкологической системы птиц (содержимое ЖКТ в совокупности с населяющей его микрофлорой) уже на стадии эмбрионального развития. При этом микроорганизмы, присутствующие в ЖКТ эмбриона, являются основой, которая определяет формирование стартового кишечного биоценоза вылупившихся цыплят и взрослой птицы. Сравнительная оценка структурных изменений в микробных сообществах кишечника кур-несушек с применением экологических подходов показала, что бактериальное сообщество слепых отростков кур в контрольном варианте характеризовалось наибольшей величиной индекса Шеннона (4,18±0,01), что указывает на наименьшую определенность и однородность состава данного микробиоценоза.

Кроме того, в той же группе были выявлены и самые высокие значения показателя индекса доминирования Симпсона (0,99 ± 0,04), что также свидетельствует о низком накоплении энтропии и определенной степени организации. Наибольшим индексом выровненности по Пиелу характеризовалось микробное сообщество слепых отростков кур, в рацион которых вводили 45% ячменя. Таким образом, в соответствии со значениями экологических индексов, у кур из контрольной группы без добавления в рацион кормовых добавок и птицы, рацион которых содержал антибиотики и подкислитель, структура микробиоценоза слепых отростков кишечника характеризовалась наибольшей неоднородностью.

Было выполнено сопоставление данных о микробиоценозах цыплят-бройлеров и кур-несушек. Микрофлора кишечника кур и бройлеров сильно различалась по составу и по структуре. Согласно проведенному кластерному анализу были выявлены более тонкие взаимосвязи между изменениями в рационах цыплят и кур. Так было показано, что внесение ячменя оказывает сходное влияние на микрофлору кур-несушек и цыплят-бройлеров. Хотя в остальных случаях большую роль в соотношении микроорганизмов в слепых отростках играет возраст птицы. Результаты исследований по проекту были продемонстрированы на российских, международных научных и научно-практических мероприятиях.

Были подготовлены научные публикации и итоговый отчёт по результатам исследований. Опубликованы 2 статьи Web of Science, 4 статьи в журналах, индексируемых РИНЦ, принята к опубликованию статья в журнале «Вопросы питания» («Scopus»), подготовлена к изданию монография, обобщающая результаты исследований по проекту.

1. Грозина А.А. Сравнительная оценка эффективности антибиотика и пробиотика при выращивании цыплят-бройлеров Птица и птицепродукты, -№6. -С.34–36. (год публикации — 2014).

2. Грозина А.А. Состав микрофлоры желудочно-кишечного тракта у цыплят-бройлеров при воздействии пробиотика и антибиотика (по данным T-RFLP-RT-PCR) Сельскохозяйственная Биология, — (год публикации — 2014).

3. Йылдырым Е.А., Ильина Л.А., Никонов И.Н., Новикова Н.И., Лаптев Г.Ю., Манукян В.А., Егоров И.А. Оценка влияния комбикормов различной структуры на микрофлору кишечника бройлеров Птица и птицепродукты, -№6. -С.40–42. (год публикации — 2014).

4. Лаптев Г.Ю., Новикова Н.И., Никонов И.Н., Ильина Л.А., Йылдырым Е.А., Филиппова В.А., Бражник Е.А., Егоров И.А., Егорова Т.В. Бактериальное сообщество кишечника бройлеров при использовании комбикормов, содержащих нетрадиционные источники белка Зоотехния, -№12. -С.29–30. (год публикации — 2014).

5. Фисинин В.И., Егоров И.А., Манукян В.А., Лаптев Г.Ю., Никонов И.Н., Ильина Л.А., Новикова Н.И. Метагеномные исследования микрофлоры кишечника птицы — основа выбора кормовых добавок Птица и птицепродукты, -№6. -С.37–39 (год публикации — 2014).

6. Ильина Л.А., Йылдырым Е.А., Никонов И.Н., Филлипова В.А., Лаптев Г.Ю., Новикова Н.И., Грозина А.А., Ленкова Т.Н., Манукян В.А., Фисинин В.И., Егоров И.А. Таксономическое разнообразие микробиома слепых отростков кишечника у цыплят-бройлеров и его изменение под влиянием комбикормов с подсолнечным шротом и сниженной обменной энергией Сельскохозяйственная Биология, Сельскохозяйственная биология, 2015, том 50, №6, с. 817–824 (год публикации — 2015).

7. Йылдырым Е.А., Ильина Л.А., Лаптев Г.Ю., Никонов И.Н., Филиппова В.А., Новикова Н.И., Фисинин В.И., Егоров И.А., Ленкова Т.Н., Манукян В.А., Грозина А.А. Микрофлора in ovo: возможности молекулярно-биологического метода T-RELP ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК, №6. – С.6–8. (год публикации — 2015).

8. Йылдырым Е.А., Ильина Л.А., Лаптев Г.Ю., Никонов И.Н., Филиппова В.А., Новикова Н.И., Фисинин В.И., Егоров И.А., Ленкова Т.Н., Манукян В.А., Грозина А.А. Микробиоценоз слепых отростков кишечника цыплят-бройлеров на фоне различной структуры питательных рационов ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК, — №6. – С.9–13. (год публикации — 2015).

9. Л.А. Ильина, Е. А. Йылдырым, И. Н. Никонов, В. А.Филиппова, Г. Ю. Лаптев, Н. И. Новикова, А. А. Грозина, Т. Н. Ленкова, В. А. Манукян, И. А. Егоров, В. И. Фисинин МЕТАГЕНОМНЫЙ ПЕЙЗАЖ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕТОДА T-RFLP Doklady Biochemistry and Biophysics, — (год публикации — 2016).

10. Лаптев Г.Ю., Йылдырым Е.А., Ильина Л.А., Новикова Н.И., Никонов И.Н., Егоров И.А., Манукян В.А. Влияние подсолнечного и соевого шротов на микрофлору ЖКТ бройлеров Комбикорма, №2. С. 68–70. (год публикации — 2015).

11. Фисинин В.И., Егоров И.А., Лаптев Г.Ю., Никонов И.Н., Йылдырым Е.А., Ильина Л.А.,Филиппова В.А., Новикова Н.И. Выявление микроорганизмов в куриных эмбрионах методом T-RFLP Птица и птицепродукты, . — №6. –С.24–26. (год публикации — 2015).

12. Фисинин В.И., Ильина Л.А., Йылдырым Е.А., Никонов И.Н., Филиппова В.А., Лаптев Г.Ю., Новикова Н.И., Грозина А.А., Ленкова Т.Н., Манукян В.А., Егоров И.А. БАКТЕРИАЛЬНОЕ СООБЩЕСТВО СЛЕПЫХ ОТРОСТКОВ КИШЕЧНИКА ЦЫПЛЯТ-БРОЙЛЕРОВ НА ФОНЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ РАЦИОНОВ РАЗЛИЧНОЙ СТРУКТУРЫ MICROBIOLOGY (MIKROBIOLOGIYA), — (год публикации — 2016).

13. Егорова Т.А., Ленкова Т.Н., Ильина Л.А., Йылдырым Е.А., Никонов И.Н., Филлипова В.А., Лаптев Г.Ю., Новикова Н.И., Грозина А.А., Манукян В.А., Фисинин В.И., Егоров И.А. ВЛИЯНИЕ ПРОБИОТИКОВ НА ОСНОВЕ Saccharomyces sp. и Bacillus subtilis НА БАКТЕРИАЛЬНОЕ СООБЩЕСТВО СЛЕПЫХ ОТРОСТКОВ КИШЕЧНИКА И ПРОДУКТИВНОСТЬ ЦЫПЛЯТ-БРОЙЛЕРОВ Сельскохозяйственная биология, №6, Т.51, С.891–902 (год публикации — 2016).

14. Ленкова Т.Н., Егорова Т.А., Манукян В.А., Егоров И.А., Фисинин В.И., Лаптев Г.Ю., Никонов И.Н., Ильина Л.А., Йылдырым Е.А., Филлипова В.А., Новикова Н.И. Сравнительная оценка влияния пробиотиков дрожжевой и бактериальной природы на продуктивность и микрофлору кишечника цыплят-бройлеров Птица и птицепродукты, №6, С.39–41 (год публикации — 2016).

15. Фисинин В.И., Егоров И.А., Егорова Т.А., Ленкова Т.Н., Манукян В.А., Лаптев Г.Ю., Новикова Н.И., Ильина Л.А., Йылдырым Е.А., Никонов И.Н., Филлипова В.А., Дубровин А.В. Влияние структуры комбикормов на микрофлору кишечника бройлеров Комбикорма, №12, С.59–61 (год публикации — 2016).

16. Фисинин В.И., Егоров И.А., Лаптев Г.Ю., Ленкова Т.Н., Никонов И.Н., Ильина Л.А., Манукян В.А., Грозина А.А., Егорова Т.А., Новикова Н.И., Йылдырым Е.А. Получение продукции птицеводства без антибиотиков с использованием перспективных программ кормления на основе пробиотических препаратов Вопросы питания, — (год публикации — 2017).

17. Фисинин В.И., Егоров И.А., Лаптев Г.Ю., Ленкова Т.Н., Никонов И.Н., Ильина Л.А., Манукян В.А., Грозина А.А., Егорова Т.А., Новикова Н.И., Йылдырым Е.А., Баркова О.Ю., Дубровин А.В., Филлипова В.А., Егорова Т.В. Современные представления о микрофлоре кишечника птицы при различных рационах питания: молекулярно-генетические подходы Современные представления о микрофлоре кишечника птицы при различных рационах питания: молекулярно-генетические подходы. Издательство «Лика», г. Сергиев Посад, — (год публикации — 2016).

18. Фисинин В.И., Егоров И.А., Ленкова Т.Н., Манукян В.А., Лаптев Г.Ю., Новикова Н.И., Никонов И.Н., Ильина Л.А., Йылдырым Е.А. Замена соевого шрота подсолнечным в комбикормах для кур-несушек Птицеводство, №12, С.15–19 (год публикации — 2016).

19. Фисинин В.И., Егоров И.А., Манукян В.А., Ленкова Т.Н., Байковская Е.Ю., Лаптев Г.Ю., Никонов И.Н., Новикова Н.И., Ильина Л.А., Йылдырым Е.А. Состояние микрофлоры желудочно-кишечного тракта кур-несушек при замене в комбикорме кукурузы пшеницей Птица и птицепродукты, №6, С. 33–36 (год публикации — 2016).

20. Фисинин В.И., Лаптев Г.Ю., Никонов И.Н., Ильина Л.А., Йылдырым Е.А., Филлипова В.А., Новикова Н.И., Грозина А.А., Егорова Т.А., Ленкова Т.Н., Егоров И.А. ИЗМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОГО СООБЩЕСТВА В ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОМ ТРАКТЕ КУР В ОНТОГЕНЕЗЕ Сельскохозяйственная биология, №6, Т.51, С. 883–890 (год публикации — 2016).


Печать страницы